编者导语
很是荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中连续宣布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容，以飨读者。承接上期，本期袁老师为各人带来外标与定量法总结的精彩解读。
作者简介
袁超博士
现任美国华人临床化学学会主席，美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位，其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后，主要研究偏向为卵白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用。
第七节 外标及定量要领总结
临床质谱这一系列文章是我两年前的夏天写的。厥后因为种种原因，一直没有再续。最近这些文章被《临床质谱检测》的小编发明了，转载了他们的推文里。在此我要谢谢他的欣赏和读者的捧场。希望各人有什么反响和要求，都可以写在留言里。
在跟这位小编接触的历程中，我们做了一些学术性的探讨，由此对以前的文章也做了些调解和修改。我们最近讨论的一个话题是外标法。小编提到了一些我忽略的知识点，所以我把外标单独写了一节，另外把种种定量的要领总结一下。再次重申，都是我的一家之言，仅供各人做参考。你们如果喜欢如下的内容，那要谢谢这位小编约稿的热情和对我的盲点的提醒。
从科技生长的历史来看，内标要比外标晚。所以应该是先讨论外标，后讨论内标。但因为是临床质谱的文章，外标这个看法基本不涉及，所以在以前的章节里，一直也没有提到外标。那么我们现在就要沿着时间的长河逆流而上，回到还没有液质联用的年代，看一看外标的兴起和衰落，以及剩余到现在的一些奇特用处。
什么是外标？外标就是独立于病人样品之外的标准品。而内标是加在病人样品里面的标准品。在绝大大都的临床检测要领里，好比光吸收和免疫法，是不必内标的，所以外标就是标准品，也没有须要做出外标和内标的区分。就似乎时区这个看法，在中美之间有差别的使用习惯。美国有好几个时区，每次开电话集会都要确定究竟是东部时间照旧西部时间。中国就一个时区，没有须要提醒各人开会是北京时间，说的话就显得有点儿画蛇添足。
外标与内标的并存和区别使用是在色谱法里最先开始的。色谱的外标其实也是标准品。色谱要领可以加内标，也可以不加内标。如果不加内标，那就是纯外标的要领，这个才是我们溯流而上要寻找的老祖宗。在纯外标的色谱法里，外标的浓度从低到高都有，上样以后经过色谱疏散，然后流到检测池，爆发一个色谱峰。色谱峰的峰高或峰面积与浓度成正比，画一条直线就是标准曲线，由此可以去算出病人样品的浓度（图一）。早期算峰面积的要领很原始：把色谱峰打印在纸上，用剪刀把峰剪下来，然后放到天平上称，用纸的重量代表峰面积。当我们感伤当年编程用手工在纸带上打孔是多原始时，色谱其实也经历了类似的翻天覆地的变革。
图一 外标法定量示意图
色谱要领进化历程中的一个重要里程碑就是内标的引入。色谱是一条河，弯来弯曲有变数。内标可以模拟被测物的行为，让定量越发准确。所以在色谱法里，内标的用法和原理是和质谱法一样的（见上一节）。也是用被测物和内标的比值来定量（图二）。但区别在内标的理化性质。色谱的内标必须要能和被测物在保存时间上离开。所以色谱的内标不可能是稳定同位素标记的，而是一个类似物，好比加了个甲基或乙�；睦嗨莆�。这样在样品前处理时，基本能代表被测物的行为，在色谱洗脱时又能和被测物离开。色谱的内标一定不可是内源性的。如果病人的样品里有内标这种化合物，那要领就不稳定了。有时候好禁止易选了个不错的内标，跟被测物类似，并且体内也没有，但没过几年，内标被FDA批准了，酿成药了，这下有些人的血液里带这个内标了，要领就需要重建了。
图二 内标法定量示意图
正是因为色谱法里引进了内标这个看法，才把以前的标准品硬生生的的给改成了外标。就似乎反向柱的泛起硬生生的把以前的色谱柱改成了正向柱。在反向柱泛起以前，色谱柱都是正向的；在内标泛起以前，外标是叫标准品的。
液质联用又是一个大的技术奔腾。它结合了液相色谱的强大疏散、纯化功效和质谱的无可相比的灵敏度、特异性。软电离让这两个技术无缝对接，优势倍增，得诺贝尔奖是实至名归。在液质联用的要领里，同位素内标的使用相当于如虎添翼，让质谱法一跃成为临床检验里的金标准，定量的标杆。讲到同位素内标，我们才又顺着历史的长河回到了当下，回到了各人都熟悉的定量要领。可是内标的讨论并没有完全结束。
有些庞大的要领，被测的物质太多，好比新生儿筛查（简称新筛），我们不可能给每一个被测物找到一个对应的内标。这个时候一些理化性质相似的被测物就要共享一个内标了，或者共享一条标准曲线了。这时候的定量就不是很是准确了。但新筛的正惯例模和不正惯例模区别很大，定量上有些偏差不影响临床的应用。
新筛要是给每一个被测物做一条标准曲线的话，这个难度很是大。许多标准品是买不到的。买到了，稳定性、准确的称量都是个问题。所以新筛用了个不得已的简单定量要领：被测物浓度即是被测物的峰面积除以内标的峰面积乘以内标的浓度。这里面有一个假设：内标的离子化水平和质谱信号强弱是和被测物相当的。注意是相当，不是相等。只要是相当的，那么用此要领建立的正常值规模就是可靠的。这样的半定量要领在新筛上用得很普及，对临床的孝敬是有目共睹的。
像新筛这样完全用内标做定量的要领对内标的稳定性有很高要求。如果时间长了内标有降解，那么做出来的结果就会偏高，就会泛起假阳性，会有很欠好的结果。如果因为过了保质期要经常去买内标，价钱贵不说，差别批次间的差别也会影响要领的稳定性。内标买来以后，怎样坚持、延长它的稳定性，这里面有许多窍门。经过跟小编商量，考虑到可能有的商业利益冲突，决定照旧不在这里透漏的为好。
在此总结一下如上讨论过的定量要领。即用外标，又用内标的要领定量最准确，在色谱和质谱里也最常见。稳定同位素的内标只能用在质谱里，色谱里的内标是类似物。类似物内标也可以用在质谱要领里（好比几个被测物共享一个内标，或共享一条标准曲线的情况），但这种定量不可称为全定量，但又比下面的半定量要好。所以我给它起了个名字叫，叫四分之三定量（共享一条标准曲线。注意，只有个体厂家的软件允许共享标准曲线）和八分之七定量（共享一个内标，可是有各自的标准曲线。各人可以自己在实验室试一下，把被测物的内标在软件里交换一下，好比维生素D3的内标换给维生素D2用。标准曲线和质控的结果都会差一些）。只用外标，不必内标的质谱要领是老要领，已经被历史所淘汰；只用外标，不必内标的色谱要领还保存，它们被历史抛弃只是时间问题。只用内标，不必外标的质谱定量要领只是用在个别的项目中，尤其是新筛的项目。在其它领域的应用还在探索历程中。对这种定量要领的普遍了解、认可、和接受还没有到来。这样的要领因为没有标准曲线，所以不是真正意义上的定量要领，只能叫半定量。这样的要领在差别实验室之间是没有步伐比较定量的，只能比较定性的结果。
这一节的技术讨论到此为止，最后跟各人分享一个我自己亲历的小故事。小时候我就是个文学青年，喜欢读小说，也喜欢写点儿工具�？垂适驴吹礁腥说牡胤�，会情不自禁，泪如雨下。成年以后，心理成熟的多了，也就不那么触景生情了。厥后接触了医疗效劳这一行，见多了生死，解剖过尸体，心也就更硬了。但那天不经意的看到一份儿病历，里面夹了一封信，一行一行读下来，不禁潸然泪下。这是一名护士写的临终纪录，纪录了一名新生儿的最后时光。专业的白描叙事里，让人如临其境，似乎能看见撒在病床上的阳光，能听见静脉输液的滴答声，不禁叹息生命的软弱和人性的温暖。那时自己初为人父，更能感同身受，理解做怙恃丧子的切肤之痛。于伤心处，不忍卒读，掩卷频频，刚刚读完。我无法重复护士的原话，执法不允许，品德也不允许。新生儿到生命的最后也没有个名字，就叫baby girl。就是这个baby girl和她的家人，对我们的新筛要领做出了巨大的、无可相比的孝敬，让我们可以一直有一个可靠的、稳定的要领去造福其他病人。我要深深谢谢这个baby girl， 也深深谢谢她的家人。
声明：本文章来源“临床质谱网”，作者：袁超博士，大发welcome生物已获得临床质谱网和袁超博士授权，如需转载，请联系原作者！
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